วิธีทดสอบเชื้อ Salmonella spp. ใช้ชุดทดสอบ Neogen (3M) PetrifilmTM Salmonella Express System

Wannisa
6 วันที่ผ่านมา
ยาว 2 นาที

อาหารเลี้ยงเชื้อ รีเอเจนต์ เครื่องมือและอุปกรณ์

1. 3M Salmonella Enrichment Base (SEB)

2. 3M Salmonella Enrichment Supplement (SESUP)

3. 3M Petrifilm Salmonella Express Plate

4. 3M Petrifilm Salmonella Express Confirmation Disk

5. Interpretation Guide และ Colony Color Card

6. Speader หรือตัวกดพลาสติก ที่เหมาะสม

7. RV (R10) 10 ml (สำหรับตัวอย่าง High microbial background)

8. Sterilized Glass Pipette หรือ Auto pipette และ Tip ขนาด 100-1,000 ไมโครลิตร

9. Stomacher และ Stomacher bags

10. Loop 10 µl

11. สารละลายปลอดเชื้อ สำหรับการทำ Plate Hydration

12. กระดาษชั่งสาร

13. ช้อนสแตนเลสขนาดเล็ก สำหรับชั่งสาร

14. ขวดแก้ว สำหรับเตรียม Enrichment

15. อุปกรณ์เตรียมตัวอย่างอื่นๆที่จำเป็น เช่น forceps กรรไกร ช้อนสแตนเลส เป็นต้น

16. ตะเกียงแอลกอฮอล์ หรือตะเกียงบุนเสน

17. ตู้บ่มเพาะเชื้อ (Incubator) ที่อุณหภูมิ 41.5 ± 1 °C

18. Autoclave

19. Loop

วิธีการทดสอบ

1. ชั่งตัวอย่าง 25 กรัม โดย Aseptic technique ลงใน Stomacher bag

2. เติมอาหารเลี้ยงเชื้อ 3M SEB+SESUP 225 มิลลิลิตร ลงไปในตัวอย่าง

2.1 นำเข้า Stomacher ตีปั่นประมาณ 2 นาที หรือทำการเขย่าตัวอย่างให้ผสมเข้ากันดี

2.2 ปิดปากถุงตัวอย่าง แล้วนำไปบ่มเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 41.5 ± 1 °C เป็นเวลา 18-24 ชั่วโมง

3. ในกรณีที่ตัวอย่างเป็นกลุ่ม High microbial background (TPC ≥ 10⁴ CFU/g) ให้ดูดตัวอย่างจากข้อ 2 ปริมาตร 0.1 ml ลงใน RV(R10) 10 ml จากนั้นนำไปบ่มที่ที่อุณหภูมิ 41.5 ± 1 °C เป็นเวลา 8-24 ชั่วโมง

4. ขั้นตอน Plate Inoculation : Streak plate

4.1 Plate Hydration มีขั้นตอนดังนี้ (ดังภาพที่ 1)

4.1.1 ดูดสารละลายปลอดเชื้อ ลงบนแผ่น Petrifilm ปริมาตร 2 ml

4.1.2 ค่อยๆ ปล่อยแผ่นฟิล์มแผ่นบนลงบนสารละลาย ระวังอย่าให้เกิดฟองอากาศ แล้วใช้ตัวกดพลาสติกที่เหมาะสมวางด้านบนตรงกลางเพลท ค่อยๆ กดตรงกลางตัวกดให้สารละลายกระจาย เต็มพื้นที่ แล้วยกตัวกดพลาสติกออก ปล่อยให้เจลแข็งประมาณ 1 ชั่วโมง โดยเก็บให้พ้นแสง

(สามารถเตรียมแผ่น แล้วเก็บไว้ในตู้แช่แข็งได้ 5 วัน)

ภาพที่ 1 แสดงขั้นตอน Plate Hydration

4.2 Streak plate มีขั้นตอนดังนี้ (ดังภาพที่ 2)

4.2.1 นำ Loop ขนาดปริมาตร 10 µl แตะตัวอย่างให้เต็มวง จากนั้นทำการ streak ลงบนแผ่นด้านล่าง โดยลากเป็นแนวเดียว (Single Streak) เพื่อให้ได้โคโลนีที่แยกออกจากกัน

4.2.2 ปล่อยฟิล์มแผ่นบนเพื่อปิดแผ่น แล้วใช้นิ้วลูบแผ่นฟิล์มด้านบนเพื่อไล่ฟองอากาศออกจากบริเวณที่มีการ streak ตัวอย่างลงไป

4.2.3 นำไปบ่มเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 41.5 ± 1 °C เป็นเวลา 24 ± 2 ชั่วโมง และสามารถวางซ้อนแผ่นกันได้ไม่เกิน 20 แผ่น

ภาพที่ 2 แสดงขั้นตอน Streak plate

4.3 อ่านผลและแปรผลบวกเบื้องต้น (ดังภาพที่ 3 - 5)

Ø เมื่อครบเวลาบ่มเชื้อ ให้นำปากกาหมึกวงกลมรอบโคโลนีของเชื้อต้องสงสัย (อาจใช้ Light box ช่วยในการอ่านผล) เลือกอย่างน้อย 5 โคโลนี เพื่อนำไปยืนยันผลต่อไป ซึ่งลักษณะของเชื้อต้องสงสัยจะแสดง 3 ลักษณะ คือ

ü โคโลนีสีแดงมีโซนสีเหลืองล้อมรอบ

ü โคโลนีสีแดงมีฟองแก๊ส

ü โคโลนีสีแดงมีโซนสีเหลืองล้อมรอบและมีฟองแก๊ส

ภาพที่ 3 แสดงลักษณะโคโลนีที่ให้ผลบวกเบื้องต้น และวงกลมรอบโคโลนีต้องสงสัย

4.4 ขั้นตอนการยืนยันผลด้วยการใช้ 3M Petrifilm Salmonella Express Confirmation Disk (ดังภาพที่ 4)

4.4.1 เปิดแผ่น 3M Petrifilm Salmonella Express Plate ด้านบนขึ้น แล้วนำแผ่น Disk ลงบนโคโลนีที่ได้ทำการวงกลมเอาไว้ แล้วค่อยๆ ปล่อยแผ่นฟิล์มด้านบนลงให้แนบกับแผ่น Disk ใช้นิ้วค่อยๆ ลูบเพื่อไล่ฟองอากาศออกจากพื้นที่การเจริญของเชื้อต้องสงสัย

4.4.2 นำไปบ่มต่อที่อุณหภูมิ 41.5 ± 1 °C เป็นเวลา 4 -5 ชั่วโมง

ภาพที่ 4

แสดงขั้นตอนการยืนยันผลโดยใช้ 3M Petrifilm Salmonella Express Confirmation Disk

ภาพที่ 5

แสดงสีของโคโลนีที่ให้ผลบวกเบื้องต้น (Presumptive Positive Salmonella) และ แสดงสีของโคโลนีที่ไม่ใช่ Salmonella (Non-Salmonella)

4.5 อ่านผลและแปรผลการยืนยันผล

Ø เมื่อครบเวลาบ่มยืนยันผล 4-5 ชั่วโมงแล้ว (อาจใช้ Light box ช่วยในการอ่านผล) ให้พิจารณาโคโลนีที่วงกลมไว้ในเบื้องต้น ถ้าเป็นเชื้อ Salmonella จะแสดงลักษณะโคโลนีมีสีน้ำเงินเข้ม-ดำ มีตะกอนสีน้ำเงิน หรือโคโลนีสีน้ำเงินเข้ม-ดำ ที่จุดกึ่งกลางมีสีแดงเข้มและมีตะกอนสีน้ำเงิน

5. รายงานผลการทดสอบ Detected หรือ Not detected ต่อตัวอย่าง 25 กรัม โดยที่

- ถ้าพบเชื้อ Salmonella spp. รายงานผล Detected in 25 g

- ถ้าไม่พบเชื้อ Salmonella spp. รายงานผล Not Detected in 25 g